Autofagi vid Parkinsons sjukdom

Datum: September 2021 
Förberedd av SIC-medlem: Hideki Mochizuki, läkare, PhD 
författare: Maria Xilouri, PhD., Dimitri Krainc, MD, PhD., Noriyuki Matsuda, PhD. 
Redaktör: Un Jung Kang, MD 

Upptäckten att mutationer i Gauchers sjukdoms (GD) genen GBA1 är en stark riskfaktor för Parkinsons sjukdom (PD) har möjliggjort unika insikter i patofysiologi centrerad kring störningar i den autofagisk-lysosomala vägen. Proteinansamlingar i form av Lewykroppar och effekterna av kanoniska PD-mutationer som konvergerar på det lysosomala nedbrytningssystemet tyder på att neurodegeneration vid PD medieras av dysreglering av proteinhomeostas. Det välkarakteriserade kliniska och patologiska sambandet mellan PD och den lysosomala lagringsstörningen GD betonar vikten av dysreglerad proteinmetabolism vid neurodegeneration, och en spännande del av detta samband är en gemensam fenotyp av autofagisk-lysosomal dysfunktion i båda sjukdomarna. Translationell tillämpning av dessa fynd kan accelereras genom användning av dopaminneuronmodeller i mitthjärnan härledda från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) som sammanfattar flera patologiska egenskaper hos GD och PD. I denna översikt diskuterar vi bevis som kopplar autofagisk dysfunktion till patofysiologin hos GD och GBA1-kopplad parkinsonism och fokuserar mer specifikt på studier som nyligen utförts på iPSC-deriverade neuroner. Upptäckten att mutationer i Gauchers sjukdom (GD)-genen GBA1 är en stark riskfaktor för Parkinsons sjukdom (PD) har möjliggjort unika insikter i patofysiologi centrerad kring störningar i den autofagisk-lysosomala vägen. Proteinaggregeringar i form av Lewykroppar och effekterna av kanoniska PD-mutationer som konvergerar på det lysosomala nedbrytningssystemet tyder på att neurodegeneration vid PD medieras av dysreglering av proteinhomeostas. Det välkarakteriserade kliniska och patologiska sambandet mellan PD och den lysosomala lagringsstörningen GD betonar vikten av dysreglerad proteinmetabolism vid neurodegeneration, och en spännande del av detta samband är en gemensam fenotyp av autofagisk-lysosomal dysfunktion i båda sjukdomarna. Translationell tillämpning av dessa fynd kan accelereras genom användning av dopaminneuronala modeller från mitthjärnan härledda från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) som sammanfattar flera patologiska egenskaper hos GD och PD. I denna översikt diskuterar vi bevis som kopplar autofagisk dysfunktion till patofysiologin hos GD och GBA1-kopplad parkinsonism och fokuserar mer specifikt på studier som nyligen utförts på iPSC-deriverade neuroner. 

Dr. Mochizuki: 
Proteinaggregering och -deponering är ett vanligt kännetecken för många neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom (PD). Felveckning av proteiner förekommer ofta i celler, och celler har utvecklat en rad mekanismer för att upprätthålla intracellulär proteinhomeostas. Som en av de viktigaste nedbrytningsvägarna medierar autofagi elimineringen av onormalt eller oönskat protein från celler. Ett växande antal studier av sjukdomsmodeller och patienter har implicerat försämrad autofagimaskineri i patogenesen av PD. Vi har bjudit in tre experter inom detta område för att diskutera den spännande kopplingen mellan autofagi och PD-relaterade gener, α-synuklein, parkin och GBA1, och det potentiella värdet av att rikta in sig på autofagivägen som en terapeutisk strategi för PD. 

Vad är din syn på sambandet mellan α-Syn och den autofagi-lysosomala vägen? 

Bevis från humana obduktionsprover och cell-/djurmodeller av Parkinsons sjukdom kopplar α-synukleinackumulering till försämrad clearance på grund av förändringar i de proteolytiska maskinerierna. Är autofagis lysosomala väg (ALP) snarare än ubiquitin-proteasomsystemet (UPS) den huvudsakliga vägen som ansvarar för α-synukleinnedbrytning? Hur mycket bidrar autofagi till utvecklingen och progressionen av α-synukleinpatologi? Å andra sidan, hur påverkar α-synukleinuttryck funktionen av autofagis lysosomala väg under patologiska förhållanden?   

Dr. Xilouri:
Både UPS och ALP har föreslagits kunna eliminera α-synuklein; dock i olika utsträckning och på ett cell-, konformations- och vävnadsspecifikt sätt. α-synuklein kan genomgå både ubiquitinberoende och ubiquitinoberoende nedbrytning via 26S/20S-proteasomen, medan endast en liten andel av lösliga cell-deriverade intermediära α-synukleinoligomerer, exklusive monomerisk α-synuklein, riktas mot 26S-proteasomen för nedbrytning. In vivo verkar UPS vara den huvudsakliga nedbrytningsvägen för α-synuklein under normala förhållanden, medan ALP rekryteras med ökad α-synukleinbelastning. Å andra sidan bryts vildtyps α-synuklein och inte de PD-länkade A53T- och A30P-formerna, den fosforylerade eller dopaminmodifierade α-synukleinen, ned via den selektiva processen med chaperonmedierad autofagi (CMA). CMA kan endast bryta ner monomera eller dimera former av proteinet, medan makroautofagi är den enda process som kan rena oligomer α-synuklein genom aggrepagiprocessen. Inte bara mutationer utan även posttranslationella modifieringar såsom fosforylering, sumoylering och ubiquitinering kan också förändra uppdelningen av α-synuklein till proteasomal eller lysosomal nedbrytning. Förutom UPS och ALP har andra proteaser såsom kalpainer och neurosin varit inblandade i klyvningen av normala eller aggregerade former av intracellulärt α-synuklein. Sådan klyvning kan främja genereringen av trunkerade α-synukleinarter med patogen betydelse. Dessutom har utsöndrat neurosin och metalloproteinaser visat sig klyva extracellulärt α-synuklein på selektiva ställen, vilket genererar fragment med ökad tendens att aggregera. 

Eftersom den totala mängden α-synukleinprotein är en avgörande faktor för utvecklingen av patologi, kan faktorer som kontrollerar dess nivåer, såsom ALP, påverka utvecklingen och progressionen av synukleinopatier. I detta avseende tyder genetiska och humana obduktionsstudier på att ALP är nedsatt vid synukleinopatier och verkar vara involverat i α-synuklein-aggregering. Störningar i ALP kan också påverka cell-till-cell-överföringen av α-synuklein, genom ökad utsöndring av fria eller exosomassocierade icke-nedbrutna former av proteinet, vilket underlättar spridningen av α-synuklein-länkad patologi i olika hjärnregioner i CNS. 

Autofagi bryter inte bara ner olika former/konformationer av α-synuklein, utan kan också vara ett mål för proteinets avvikande effekter. Ökad α-synuklein har rapporterats försämra makroautofagin både in vitro och in vivo, möjligen genom dess interaktion med Rab1a, vilket orsakar fellokalisering av Atg9, ett protein relaterat till autofagosombildning. Det finns också bevis som tyder på att de PD-länkade α-synukleinmutationerna kan påverka makroautofagimaskineriet i olika stadier (makroautofagiinitiering, bildning av autofagosomer, autofagosommognad och fusion av autofagosomer med lysosomen). Dessutom har A53T-mutationen visat sig dysreglera det selektiva avlägsnandet av mitokondrier genom mitofagi, vilket resulterar i massivt mitokondrieborttagning åtföljt av bioenergetiska underskott och neuronal degeneration. När det gäller CMA har det rapporterats att de A30P- och A53T PD-länkade mutanta α-synukleinformerna binder starkare till LAMP2A, CMA:s specifika receptor, men inte tas upp och bryts ned i lysosomer, vilket blir toxiskt genom att hämma den CMA-medierade nedbrytningen av andra cytosoliska substratproteiner. Dessutom förändrar posttranslationella modifieringar av vildtyp α-synuklein, såsom oxidation och nitrering av proteinet, dess bindning och upptag i lysosomer, medan fosforylering och dopaminmodifiering nästan helt förhindrar dess CMA-beroende nedbrytning. Dessutom kan extracellulärt α-synuklein utlösa autofagisk försämring i mottagarceller vid dess upptag, vilket observeras av en ansamling av förstorade defekta lysosomer, vilket ytterligare bidrar till spridningen av patologin. Avvikande α-synuklein kan också påverka lysosomal aktivitet i sig, genom att förändra aktiviteten hos lysosomala enzymer, såsom katepsiner och GCase. 

Huruvida ALP-fel är den primära orsaken till synukleinopatier eller uppstår sekundärt, delvis genom försämring av dessa vägar av avvikande α-synukleinarter, återstår att studeras vidare.    

Hur kopplar dysfunktion i autofagi-lysosomal signalväg länken mellan GBA1 och Parkinsons sjukdom? 

Mutationer i Gauchers sjukdomsgen, glukokerebrosidas (GBA1), ökar risken för Parkinsons sjukdom. Glukokerebrosidas (GCase)-brist har också observerats hos idiopatiska Parkinsons sjukdomspatienter utan GBA1-mutation. Det är värt att notera att autofagisk lysosomal dysfunktion är en gemensam fenotyp hos båda sjukdomarna. Hur påverkar glukokerebrosidasbrist den autofagiska lysosomala vägen och bidrar så småningom till Parkinsons patogenes? 

Dr. Krainc: 
Mekanistiskt resulterar förlust av GCase-aktivitet i ansamling av glukosylceramid (GluCer) vilket stabiliserar toxiska lösliga oligomera former av α-synuklein med hög molekylvikt. Viktigt är att en liknande effekt på α-synuklein inte ses med andra sfingolipider, och ansamling av dessa toxiska mellanformer av α-synuklein verkar vara reversibel med utarmning av GluCer, vilket tyder på att GluCer har en specifik koppling till α-synukleinackumulering. Medan minskad GCase-aktivitet resulterar i α-synukleinackumulering, kan α-synuklein i sin tur försämra lysosomalt GCase-aktivitet i neuroner. I synnerhet stör α-synuklein transporten av GCase och andra lysosomala hydrolaser från ER, vilket resulterar i ansamling av den omogna ER-formen av GCase och en minskning av post-ER GCase. Minskad lysosomalt GCase-aktivitet resulterar i sin tur i ansamling av lipidsubstrat och lysosomal dysfunktion. Försämrad transport av GCase som svar på α-synukleinackumulering medieras åtminstone delvis av SNARE-proteinet ykt6, vilket spelar en nyckelroll i ER-Golgi-transporten. Ykt6 inaktiveras av α-synuklein vilket resulterar i försämrad transport av GCase och andra lysosomala enzymer, och därmed minskad GCase-aktivitet i det lysosomala utrymmet. Ytterligare bevis har visat att GCase och α-synuklein också kan interagera direkt med varandra. 

Eftersom α-synukleinackumulering är vanlig för alla former av Parkinsons sjukdom, kan effekten av α-synuklein på lysosomalt GCase-aktivitet ses även hos de Parkinsons-individer utan patogena GBA1-mutationer. Faktum är att GCase-aktiviteten är minskad i hjärnan hos Parkinsons-patienter både med och utan GBA1-mutationer, inklusive patienter med sporadisk Parkinsons sjukdom utan känd patogen mutation. Det dubbelriktade sambandet mellan GCase-aktivitet och α-synuklein kan resultera i en kritisk patogen återkopplingsslinga som resulterar i ihållande α-synukleinackumulering och lysosomal dysfunktion, vilket i slutändan leder till progressiv neuronal förlust.  

Dysreglerad metabolism av dopamin i sig kan åtminstone delvis förklara sårbarheten hos dopaminerga neuroner i synukleinopatierna, eftersom dopaminberoende toxisk kaskad har visat sig orsaka lysosomal dysfunktion. Intressant nog har oxiderad dopamin en direkt inverkan på GCase, vilket framgår av upptäckten att inkubation av rekombinant GCase med dopamin minskar GCase-enzymaktiviteten, och att dopaminkinoner modifierar cysteinrester i det katalytiska sätet för detta enzym. 

Hur är autofagireceptorn och autofagirelaterade proteiner (ATG) involverade i parkinmedierad mitofagi under normala och patologiska förhållanden? 

Mutationer i Parkin orsakar tidig Parkinsons sjukdom. Parkin binder, ubiquitinerar och riktar in sig på skadade mitokondrier för autofagisk eliminering. Kan du uppdatera oss om hur autofagireceptorer och autofagirelaterade proteiner (ATG) rekryterar ubiquitinerade mitokondrier till autofagosombildningsställen? 

Dr. Matsuda: 
I däggdjursceller samverkar de orsakande genprodukterna för ärftlig Parkinsons sjukdom, PINK1 (ett serinkinas) och Parkin (ett E3 ubiquitinligas), för att ubikvitylera skadade mitokondrier och därigenom utlösa mitofagi (Ref 1, Onishi et al., 2021). Fem typer av autofagiadapterproteiner (p62/SQSTM1, NBR1, NDP52/CALCOCO2, OPTN/optineurin och TAX1BP1) har identifierats i däggdjursceller som kopplar ubikvitylerade proteiner med autofagisk nedbrytning. År 2015 visade CRISPR/Cas9-medierade experiment att två av dessa adaptrar, NDP52 och OPTN, är avgörande för Parkinberoende mitokondriell autofagi (dvs. mitofagi) (Ref 2, Lazarou et al., 2015). Nästa pusselbit är att avgöra vilka autofagirelaterade faktorer (ATG) som samarbetar med NDP52 och OPTN i mitofagi. 

Det är väl accepterat att autofagiadaptrar (p62/SQSTM1, NBR1, NDP52/CALCOCO2, OPTN/optineurin och TAX1BP1) binder till både ubiquitin och LC3, och att dessa interaktioner spelar en roll i autofagisk nedbrytning av ubiquitylerade målproteiner. LC3 är ett evolutionärt konserverat autofagirelaterat protein som lokaliseras på isoleringsmembranet och autofagosomer. I detta scenario tros bindningen av LC3 av autofagiadaptrar främja rekryteringen av befintliga isoleringsmembran till områden i närheten av mitokondrier som ett tidigt steg i mitofagi. 

Den nuvarande modellen är dock begränsad eftersom den inte tillräckligt förklarar alla experimentella resultat. Även om alla autofagiadaptrar kan transporteras till skadade mitokondrier och binda LC3 (Ref 3, Yamano et al., 2020), krävs endast NDP52 och OPTN för mitofagi (Ref 2, Lazarou et al., 2015). Detta tyder på att NDP52 och OPTN har viktiga funktioner utöver att "binda LC3" som främjar ubiquitinberoende mitofagi i däggdjursceller. 

Nyligen rapporterades det att NDP52 och OPTN binder till autofagiinitieringsfaktorer utöver LC3 (Ref 3, Yamano et al., 2020; Ref 4, Vargas et al., 2019). En studie från 2019 fann att en SKITCH-domän i NDP52 binder till FIP200 (Ref 4, Vargas et al., 2019), en komponent i ULK1-kinaskomplexet som fungerar som en autofagiinitieringsfaktor. På liknande sätt visade en studie från 2020 att OPTN binder till ATG9 via en leucin-blixtlåsdomän (Ref 3, Yamano et al., 2020). ATG9 är unikt bland ATG-proteiner genom att det är ett multipelt transmembranprotein som är essentiellt för autofagi och tros spela en roll i expansionen av vesiklar (ATG9-vesiklar) som fungerar som frön för autofagosomen.  

Sammanfattningsvis är två processer viktiga för Parkin-beroende mitofagi i däggdjursceller. Den ena är NDP52/OPTN-beroende bindning av LC3, vilket rekryterar befintliga isoleringsmembran till mitokondrier. Den andra processen är också NDP52/OPTN-beroende men involverar bindning av autofagiinitieringsfaktorer såsom ATG9 och FIP200. Dessa interaktioner är viktiga för att främja ackumulering av ATG9-vesiklar och ULK1-komplex nära mitokondrier, vilket krävs för de novo-syntes av isoleringsmembranet och effektivare induktion av mitofagi. 

Upptäckten att mutationer i Gauchers sjukdoms (GD) genen GBA1 är en stark riskfaktor för Parkinsons sjukdom (PD) har möjliggjort unika insikter i patofysiologi centrerad kring störningar i den autofagisk-lysosomala vägen. Proteinansamlingar i form av Lewykroppar och effekterna av kanoniska PD-mutationer som konvergerar på det lysosomala nedbrytningssystemet tyder på att neurodegeneration vid PD medieras av dysreglering av proteinhomeostas. Det välkarakteriserade kliniska och patologiska sambandet mellan PD och den lysosomala lagringsstörningen GD betonar vikten av dysreglerad proteinmetabolism vid neurodegeneration, och en spännande del av detta samband är en gemensam fenotyp av autofagisk-lysosomal dysfunktion i båda sjukdomarna. Translationell tillämpning av dessa fynd kan accelereras genom användning av dopaminneuronmodeller i mitthjärnan härledda från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) som sammanfattar flera patologiska egenskaper hos GD och PD. I denna översikt diskuterar vi bevis som kopplar autofagisk dysfunktion till patofysiologin hos GD och GBA1-kopplad parkinsonism och fokuserar mer specifikt på studier som nyligen utförts på iPSC-deriverade neuroner. 

Autofagi har beskrivits som ett tveeggat svärd eftersom både bristande och överdriven autofagi kan vara skadliga. Vad är dina åsikter om potentialen i att utveckla terapeutiska medel som ökar autofagiaktiviteten för Parkinsons sjukdom? 

Dr. Xilouri: 
Att förbättra nedbrytningen av α-synuklein representerar ett attraktivt kandidatalternativ för behandling som syftar till att minska inte bara de intracellulära proteinnivåerna, utan även den extracellulära proteinpoolen, vilket i allt högre grad erkänns som en potentiell nyckelaktör i spridningen av synukleinopati. Olika metoder för att rikta in sig på ALP har visat sig vara framgångsrika i både cellulära och djurmodeller av α-synuklein. I synnerhet har det rapporterats att ökning av makroautofagi via mTOR-beroende (rapamycin) eller mTOR-oberoende farmakologiska och nutritionella modulatorer (Metformin, Nilotinib, AICAR, Trehalos, Resveratrol, Granatäpple, C1) förbättrar autofagosombildning, lysosombiogenes och lysosomfunktion och därmed främjar α-synukleinclearance. Dessutom har molekylär modulering av makroautofagi via överuttryck av Atg7, Beclin1 eller TFEB också rapporterats ha gynnsamma effekter på α-synukleinrelaterad toxicitet. Å andra sidan har det också visat sig vara framgångsrikt att rikta in sig på CMA genom molekylär uppreglering av LAMP2A-uttryck eller applicering av kemiska modulatorer såsom retinsyrareceptor alfa (RARα)-antagonister för att lindra α-synuklein-associerad toxicitet. När det gäller CMA-förbättring verkar detta tillvägagångssätt ha potential att minska α-synukleinnivåerna och samtidigt mildra proteinets skadliga effekter på lysosomfunktionen, vilket i själva verket "slår två flugor i en smäll". Slutligen har återställande av korrekt enzymatisk aktivitet hos GCase visat sig förbättra lysosomfunktionen och minska α-synukleinnivåerna. 

Sådana metoder bör dock hanteras med försiktighet, eftersom okontrollerad manipulation av de globala α-synukleinnivåerna kan leda till neurotoxicitet på grund av proteinets rådande roll i synaptisk neurotransmission. När det gäller nedbrytningsmaskineriet i synnerhet antar experimentella fynd att sådana strategier innebär omfattande kunskap om dosering och tidpunkt för applicering, ett faktum som kan begränsa deras nuvarande terapeutiska tillämpbarhet. Andra har rapporterat att induktion av makroautofagi under specifika omständigheter kan ha skadliga effekter, och därför bör den terapeutiska nyttan av kemiska modulatorer av makroautofagi eller till och med CMA undersökas noggrant med tanke på att de kan vara involverade i en mängd olika processer. Sammantaget kan riktad manipulation av selektiva ALP-komponenter, snarare än bred autofagistimulering, vara en säkrare strategi för utveckling av nya farmakologiska terapier vid Parkinsons sjukdom.  

Dr. Matsuda: 
Autofagi är involverad i ett flertal biologiska processer, och som påpekats kan både bristande och överdriven autofagi vara skadlig. Därför kan det vara svårt att uppnå en terapeutisk strategi för Parkins sjukdom att öka autofagisk aktivitet utan skadliga effekter. Istället kan vi överväga en terapeutisk strategi som ökar Parkins aktivitet i sig. I allmänhet är det svårt att aktivera proteinfunktionen. Men när det gäller Parkin undertrycks dess enzymatiska aktivitet via autohämning, och kan således aktiveras genom "hämning av de autohämmande mekanismerna". Faktum är att flera "hyperaktiva mutationer (V224A, W403A och F146A)" som frisätter autohämningen och aktiverar Parkins E3-funktion har hittats, och intressant nog räddades den försämrade mitofagiska aktiviteten hos patogena Parkin-mutationer genom införlivande av en hyperaktiv mutation (Ref 5, Yi et al., 2019). Genom att söka efter småmolekylära föreningar som främjar effekter på Parkins aktivitet liknande mutationerna V224A, W403A och F146A, kan det således vara möjligt att utveckla en terapeutisk strategi för Parkinsons sjukdom via Parkinaktivering. 

Slutsats 

Nya framsteg inom området har visat att flera Parkinsonsrelaterade gener och nedsatt autofagi bildar en dubbelriktad patogen loop, vilket förvärrar Parkinsons progression. Den avgörande frågan som måste tas upp är den terapeutiska potentialen hos autofagiförstärkande medel mot Parkinsons sjukdom. Medan ökad autofagiaktivitet kan kompensera för den minskade nedbrytningen av patogena proteiner, kan överaktivering av autofagi orsaka överdriven lysosomal clearance och därefter cellstress. Framtida läkemedelsutveckling riktad mot autofagi bör syfta till att bestämma tröskeln som avgör om autofagi tenderar att spela en roll som pro-överlevnad eller pro-död. Ett alternativt alternativ skulle vara att rikta in sig på selektiva ALP-molekyler, såsom parkin och GCase, som kräver mindre men inte helt ingen oro för sina tröskeleffekter. I allmänhet har studier visat att parkinöveruttryck utövar en framträdande skyddande roll för neuronal överlevnad. Det pågår också en klinisk prövning av Ambroxol, ett farmakologiskt chaperon som kan förbättra GCase-aktiviteten för Parkinsons patienter med eller utan GBA1-mutationer. Men som alltid måste dosering, effekt och säkerhet för varje potentiellt terapeutiskt medel bestämmas noggrant. 

Referenser: 

1. Onishi M, Yamano K, Sato M, Matsuda N, Okamoto K. 2021. Molekylära mekanismer och fysiologiska funktioner hos mitofagi. EMBO J 40: e104705. 

2. Lazarou M, Sliter DA, Kane LA, Sarraf SA, Wang C, Burman JL, Sideris DP, Fogel AI, Youle RJ. 2015. Ubiquitinkinaset PINK1 rekryterar autofagireceptorer för att inducera mitofagi. Nature 524:309-314. 

3. Yamano K, Kikuchi R, Kojima W, Hayashida R, Koyano F, Kawawaki J, Shoda T, Demizu Y, Naito M, Tanaka K, Matsuda N. 2020. Kritisk roll för mitokondriell ubiquitination och OPTN-ATG9A-axeln i mitofagi. J Cell Biol 219(9):e201912144. 

4. Vargas JNS, Wang C, Bunker E, Hao L, Maric D, Schiavo G, Randow F, Youle RJ. 2019. Spatiotemporal kontroll av ULK1-aktivering av NDP52 och TBK1 under selektiv autofagi. Mol Cell 74:347-362 e346. 

5. Yi W, MacDougall EJ, Tang MY, Krahn AI, Gan-Or Z, Trempe JF, Fon EA. 2019 Landskapet av Parkinvarianter avslöjar patogena mekanismer och terapeutiska mål vid Parkinsons sjukdom. Hum Mol Genet. 2019 28(17):2811-2825.