Rörelsestörningars historia: Upptäckten av alfa-synuklein och Lewykroppar

Så välkommen Maria Grazia. Det är ett nöje och en personlig ära att ha dig med i podden. Jag vill börja med att be dig ge oss [00:01:00] ett historiskt perspektiv på hur du, och naturligtvis ditt team, kom fram till upptäckten att alfa-synuclein finns i Lewykroppar.

[00:01:08] Dr. Maria Grazia Spillantini: Okej. Ja, det är lite historia. Så i början av 1990-talet arbetade vi med Michel Goedert och försökte identifiera den posttranslationella modifieringen av tau-protein i neurofibrillära trassel vid Alzheimers sjukdom. Och ett tillvägagångssätt var att producera antikroppar mot hjärnextrakt från Alzheimerspatienter och därmed i kontrollpersoner.

Men vid någon tidpunkt upptäckte vi att en antikropp som vi hade framkallat inte bara kände igen tau, utan även två mindre band med olika molekylvikter, så vi blev intresserade av att försöka fastställa vad dessa små band, som var ungefär 15 kilodalton, 14 kilodalton, var. Och det här började som ett sidoprojekt i labbet med Ross Jakes, som var tekniker i Michels labb.

Och vid den tiden doktorerade jag alldeles i början. Sedan var jag postdoktor och slutligen föreläsare vid universitetet under studiet av alfa-synuclein, skulle jag säga. Och vi fann att dessa två band var homologa. Och när vi sekvenserade dem bestämde vi oss också för att producera antikroppar som kände igen deras aminoterminala region, karboxiterminala region, mellanregionen, och sedan också att de kunde skilja mellan de två.

Och sedan åkte Michel till ett möte i Japan och Saito presenterade cDNA-sekvensen för ett protein som han kallat plackkomponent. Och detta protein var identiskt med ett av de två proteiner som vi hade hittat från skikten av den mänskliga hjärnan. Så vi blev förvånade eftersom vi aldrig såg färgning av amyloidplack och vi hade alla dessa antikroppar. Så [00:03:00] just häromdagen när jag städade upp mitt kontor hittade jag ett fax som jag hade utbytt med Saito om att vi inte hittade detta protein i plack. Och så skickade han mig sin antikropp för testning och han hade rätt. Hans antikropp färgade plack, men inte våra antikroppar.

Så vi fortsätter detta arbete och sedan såg Michel att denna sekvens av dessa två proteiner var homolog med en som beskrevs i Torpedo California av Marto och Shela år 1988, och de kallade detta protein synuclein eftersom det i fisken var fördelat både i kärnan och i synapserna.

Och med tanke på homologierna mellan dessa två proteiner bestämde vi oss för att kalla dem alfa- och beta-synuklein. Och medan det som identifieras som alfa-synuklein var samma plackkomponent [00:04:00] hos Seito, liknade det andra fosfoneuroproteinet 14 extraherat från nöthjärna. Så det hade aldrig undersökts i en mänsklig hjärna.

Och så började namnet alfa beta-synuclein därifrån. Och vid den tidpunkten bestämde jag också den kromosomala lokaliseringen av generna som kodar för dessa två proteiner. Och jag minns att vi skickade data till genomik. Vi skickade in data och redaktören bad oss ​​att ge ett namn till de två generna. Så vi kallade dem SNCA och SNCB för att skilja de två åt. Så när vi fortsatte arbetet, men som sagt, det var ett projekt på plats, även om vi efter att Seito publicerade plackkomponenten blev mycket mer intresserade och vi fann att alfa-synuclein verkligen, verkligen, mycket rikligt förekom i hjärnan som beskrivits, och det var huvudsakligen lokaliserat både [00:05:00] beta och alfa i synapsterminalen.

Och det är så vi hamnar i att identifiera alfa-beta-synuklein för att namnge dem och sedan även generna som kodar för dem. Och vi hade många antikroppar. Och vi visste en hel del om detta protein, så mycket att ett av dem, alfa-synuklein, var väldigt, väldigt bra i varje experiment. Immunoprecipitation var också immunogenicitet mot denna antikropp.

Så Ross Jakes bestämde sig för att kalla proteinet som vi sedan kallar alfa-synuklein för "perfektion", eftersom alla experiment du gör verkade fungera. Och det andra var ofullkomligt, eftersom beta-synuklein inte var så bra. Och det är så alfa-beta uppstod och hur vi fick reda på den kromosomala lokaliseringen. 

Och sedan 1996 upptäcktes kopplingen mellan den första familjen med ärftlig Parkinsons sjukdom och exakt den plats där alfa-synukleinet [00:06:00] fanns.

Jag försökte hitta lite DNA, bara av ren nyfikenhet, men vi var inte genetiker. Vi hade inget DNA, vi hade inga kopplingar, så vi var tvungna att vänta. Och sedan året därpå fick vi veta att en mutation faktiskt hade hittats i alfa-synukleingenen. Så vi hade alla verktyg. Vi hade antikroppen, vi hade kunskap om proteinet, vi visste hur de ser ut i hjärnan, men vi arbetade främst med Alzheimers och frontal temporal demens och så vidare.

Så jag gick till hjärnbanken i Cambridge och frågade efter några Parkinson-hjärnor. Och jag letade också efter hjärnor med Lewy-kroppsdemens för att se om dessa Lewy-kroppar som var karakteristiska för Parkinsons sjukdom, neuropatologiskt, innehåller detta protein. Men dessa var inte familjära fall.

De var alla sporadiska fall av Parkinsons sjukdom. Så jag använde antikroppen jag hade och färgade den initialt i någon Parkinsons hjärna. Och det var [00:07:00] underbart första gången jag såg Lewykroppen i mikroskopet, sent på natten, och sedan är det faktiskt den som också finns med i tidningen, för jag ringde alla som var i närheten för att visa dem den i mikroskopet, eftersom det är verkligen imponerande att titta på den här strukturen i mikroskopet. Problemet var att vi inte hade någon Lewykroppsdemens i hjärnbanken här. De hade den inte, så Michel samarbetade med John Trojanowski och Tao. Och han frågade dem om någon form av Lewykroppsdemens.

Så skickade John oss några avsnitt från fyra fall av Lewy-kroppsdemens, och jag har fortfarande kvar lådan eftersom jag aldrig slängde bort något när jag skrev och berättade om fallet. Så vi upptäckte att det faktiskt fanns mycket synucleinfärg i dessa fall, både från avsnitten som John skickade med Lewy-kroppsdemens och det som hade Parkinson som vi hade här.

Och från det ögonblicket var det vackert att se att vi hittade en Lewykropp. [00:08:00] Vad vi nu vet är en Lewykropp i Alzheimers hjärna. Den här stora klumpen som jag trodde kanske var Golgi-sjukan, kanske endoplasmatiskt retikulum. Så jag visade det för flera neuropatologer. Och frågade, vad är det här? För jag har aldrig sett en Lewykropp hos alla Alzheimerspatienter.

De är inte runda, fint formade som hos den substantiella nigra. Och det var det första mötet mellan synuklein och Lewykroppen. Men sedan var vi tvungna att visa att det hade någon relevans eftersom det finns många proteiner som fastnat i Lewykroppen. 

Så vi var tvungna att extrahera filamentet, och vi extraherar det från demenspatienters hjärna med Lewybody-sjukdom, och sedan även från en multipel systematrofi eftersom de liknar varandra i typ av inneslutningar, även om de inte var Lewybody-celler utan gliaceller. Och sedan försökte vi rekonstruera filamentet med hjälp av rekombinant alfa-synuclein. Och genom att bara skaka, som många gör nu, kunde vi se detta rekombinanta protein och vi [00:09:00] genom nanoguldmärkning att det var identiskt med den vi instruerade från filamentet.

Och det indikerade att alfa-synucleinet i själva verket var komponenten i dessa filament i Lewykroppen. Och det är vad vi publicerade tidigare.

[00:09:16] Dr. Tiago Outeiro: Det där är historia. Wow, det är verkligen intressant. Det visar hur viktigt det är att vara uppmärksam på detaljer och hur du och Michel kopplade ihop all information ni läser om. Så det är verkligen intressant. Och jag vill ta upp något du just nämnde.

Vanligtvis läser vi i alla artiklar att alfa-synuklein är huvudkomponenten i Lewykroppar. Vet vi hur stor andel alfa-synuklein som representerar Lewykroppar när ni gjorde era extraktioner? Kan du uppskatta att vi vet att det finns många andra proteiner, men hur stor är andelen synuklein i Lewykroppen?

[00:09:49] Dr. Maria Grazia Spillantini: Vi har aldrig riktigt mätt procentandelen i sig, eftersom man måste dissekera Lewykroppen för att veta det, och faktum är att det sker en utveckling i Lewykroppsbildningen. Så man har bleka [00:10:00] kroppar som är mycket lösare. De har färre filament, de har fler organeller runtomkring, och sedan blir de mer och mer kompakta.

Det finns rapporter som säger att ungefär 90 % av innehållet i Lewykroppen är alfa-synuclein. Andra säger att vävnaden kan variera från nanogram till mikrogram, så jag vet inte exakt eftersom det beror på hjärnans area, antalet Lewykroppar och hur man sedan egentligen dissekerar dem. Men vad jag vill säga är att jag inte tror att det där "major" egentligen har att göra med innehållet.

Jag tror att det är bättre att säga "main" eftersom vi menade att filamentet som bildade synukleinet är huvudkomponenten som utgör skelettet i Lewykroppen. Och när man har den här strukturen i cytoplasman kan den finnas bredvid filamentet. Även granulärt alfa-synuklein, oligomerer och så vidare, [00:11:00] många andra proteiner förblir fastnade på det.

Så du har mycket chaperonprotein, många enzymer. Du har ett cytoskelettprotein. Vissa säger att det finns hundrafemtio till hundra proteiner som identifierats som fästa eller som kommer ut om man träffar Lewykroppen. Men om det inte finns filamenten av alfa-synuclein, har du inte den här typen av kompakt aggregation av annat protein som fastnar där.

Så jag tror att betydelsen huvudsakligen är huvudkomponenten, för utan synucleins filament har man inte Lewykroppen. Och i andra änden finns det också något annat. Lewykroppen är en aspekt av det, eftersom det finns de små synaptiska aggregaten som enligt min mening är väldigt viktiga.

Så Lewykroppen är något som stör neuronens soma. Störd transport, men de synaptiska aggregaten som inte är lika stora som Lewykroppen, de [00:12:00] stör verkligen synapsens funktion och därmed dysfunktionen i dopaminfrisättning och så vidare. Så, ja, jag tror att man måste se det i sammanhanget, Lewykroppen är viktig. Men det finns också dessa andra aggregat av synuklein.

[00:12:15] Dr. Tiago Outeiro: Du ger mig en bra ledtråd här eftersom jag ville gå vidare med detta och jag ville fråga dig, vi läser så mycket nuförtiden. Det finns så många åsikter och folk ifrågasätter faktiskt om Lewykroppspatologi är relevant och om Lewykroppar är boven i dramat, eller om den toxicitet som vi verkar tro sker i närvaro av alfa-synuklein beror på aggregaten, eller beror det på att dess funktion går förlorad när alfa-synuklein aggregerar i Lewykroppar eller i de mindre aggregat som du nämnde. Vad tror du är mest relevant? 

[00:12:51] Dr. Maria Grazia Spillantini: Jag tror att detta till exempel är min personliga åsikt, men baserat också på de resultat vi har haft på möss, är det de synaptiska aggregaten [00:13:00] som stör funktionen till den initiala dopaminfrisättningsdysfunktionen och så vidare. Och där börjar aggregationen och synukleinet börjar också aggregera i somat.

Vi vet inte om det är skyddande eller inte i början, men när man har en stor Lewykropp stör det transporten, traffickingen i somat, helt och hållet och blir säkerligen toxiskt, men jag vet inte om det är en funktionsförlust vid synapsen, som beror på denna aggregering. Så man har SINAPS, återigen, av toxisk funktion på grund av aggregaten, men man har också en normal funktionsförlust eftersom synuklein är involverat i rörelsen av vesiklarna som innehåller neurotransmittorerna. Och så, till exempel, i experiment som vi har gjort på våra transgena möss där vi har aggregering av alfa-synuklein, både i cellkroppen och i synapsen, finner vi att dysfunktionen vid synapsen verkar fortsätta dysfunktionen i cellkroppen. [00:14:00] Så förlusten av dopaminfrisättning i striatum kommer tidigare än den neuronala döden av dopaminerga celler i cellkroppen. Och när vi använder oligomodifierare eller chaperonprotein för att störa dessa små aggregat som vi vet kolokaliserar med nervproteiner och därför är det en fullständig störning av systemet i de presynaptiska terminalerna och kan vara postsynaptisk.

Vi har studerat många presynaptiska molekyler. Sedan finner vi en enorm ökning av monomeriskt synuklein, och frågan är om det finns färre aggregat. Aggregaten blir mindre, och det finns också en ökning av monomeriskt alfa-synuklein på samma ställe. Så det som är relevant är ökningen av monomeriskt synuklein eller minskningen av aggregatet.

Och jag tror att det här är en viktig fråga som vi måste försöka besvara för att förstå. För till exempel försöker många människor hämma [00:15:00] alfa-synukleinuttrycket, minska alfa-synukleinet för att undvika bildandet av aggregat. Men tänk om aggregaten fortsätter att bildas och man bara minskar det normala synukleinet som fortfarande kan vara funktionellt? Så jag vet inte om vi i detta skede vet säkert att i detta tillstånd, eftersom reduktionen av alfa-synuklein i normal hjärna, händer ingenting. Det finns många möss som inte har alfa-synuklein och knockout eller spontan mutation, men i samband med aggregationen kommer det att vara mycket viktigt att ta reda på det.

Jag är säker på att det förmodligen är aggregaten som är boven i dramat. De är den toxiska funktionsförstärkningen. Men vi bör inte heller glömma det monomera synukleinet.

[00:15:47] Dr. Tiago Outeiro: Absolut. Du tog upp en viktig fråga, så finns det någon annan stor öppen fråga inom området som du tycker är viktig att lyfta fram? För kanske har vi fler yngre forskare [00:16:00] som ger sig in i området och kanske får de några idéer från dig om vad de egentligen borde fokusera på.

[00:16:05] Dr. Maria Grazia Spillantini: Ja, jag tror att det finns så mycket att göra ännu, det är nyfikenhet som driver, så som det här till exempel, vad är det som gör att synukleinet börjar aggregera? Tja, vad är utlösande faktorn eftersom det kan vara synapsen som vi tror eftersom vi ser dysfunktionen där, men du har också aggregat av synuklein, oligodendrocyter, varifrån det kommer.

Och nu har det arbete med kryo-EM som har utförts visat att det tydligt finns en skillnad i formen på aggregaten som kommer från Parkinsons sjukdom och demens med Lewykroppssjukdom och multipel systematrofi. Och vi vet att de finns i olika celltyper, så man kan ha samma aggregat i olika celltyper.

Så vad är utlösande faktorer? För man behöver förmodligen ha en gemensam nämnare som utlöser aggregeringen, men det finns också faktorer i de olika celltyperna som inducerar en annan [00:17:00] känslighet. Så jag tror att det här är väldigt viktiga frågor eftersom man borde veta. Den andra viktiga frågan är, vad gör synuklein?

Om du läser litteraturen nu, så finns det allt. Du kan hitta vilken funktion som helst för synuclein, men i hjärnan, förutom att vara involverat i att binda synaptiska vesiklar eller lipidmembran, i synnerhet, eller till exempel i plasticitet, vet vi att det är involverat i plasticitet genom det arbete som har gjorts på fåglar.

Och så fanns det den här rapporten om att papegojor hade aggregat av alfa-synuclein. Men det viktiga är vad den verkliga funktionen är? Varför har vi så mycket? För det är nästan 1% av hjärnans totala proteininnehåll. 

Och det tror jag kommer att vara väldigt viktigt att ta reda på. Men också vad som orsakade aggregeringen, det är de två saker som jag tror skulle vara viktiga att fokusera på.

[00:17:56] Dr. Tiago Outeiro: Toppen. Maria Grazia, tack så mycket. Det har varit [00:18:00] en ära att ha dig med i podden och diskutera alla dessa idéer och höra från dig själv hur du gjorde den där första upptäckten som startade hela området. Så tack så mycket för din tid. Det var verkligen ett nöje. Och jag ser fram emot att prata med dig vid ett annat tillfälle om något av det spännande arbete du gör.

[00:18:20] Dr. Maria Grazia Spillantini: Tack så mycket Tiago. Tack för att jag fick vara med. Tack.

[00:18:24] Dr. Tiago Outeiro: Tack. Vi har precis intervjuat Dr. Maria Grazia Spillantini för podcastserien History of Movement Disorders. Tack alla för att ni lyssnade och häng med i våra kommande poddar. Hej då.